Северо-восточная Индия — одна из основных горячих точек агробиоразнообразия в мире, где выращивают более 10 000 различных местных сортов риса, включая как ароматный, так и неароматический рис (Mao et al., 2009). Особые среди них — местные сорта с отчетливым запахом, такие как сорта Джоха Ассама (Talukdar et al., 2017), сорта Чахао сорта Манипур, сорта Тай сорта Мизорам и сорта Кампти Аруначал-Прадеш, выращенные в Аруначал-Прадеше. и сохраняются фермерами на протяжении многих лет и распределены по разным экологическим нишам (Durai et al., 2015; Roy et al., 2015). Штат Манипур на северо-востоке Индии — это изолированный холмистый регион, окруженный девятью горными хребтами и центральной долиной с климатом от тропического до субальпийского (GoM, 2018). Chakhao , что в переводе с Manipuri означает «восхитительный рис», является самым популярным ароматным рисом Манипура, который также включает несколько менее известных местных сортов. Сорта Chakhao имеют рисовые зерна либо пигментированные (черный, amubi ), либо непигментированные (белые, angouba ). Сорта с окрашенным околоплодником отличаются от других сортов риса, происходящих из разных частей Индии (Gayacharan et al., 2018; Tulsiram et al., 2018). В частности, для социально-культурных целей, фермеры выращивают несколько местных сортов Чахао , таких как Чахао Пурейтон , Чахао Амуби , Чахао Семпак , Чинг Чахао , Чахао Ангуба в небольших районах, на небольших участках имеется ферма . более 10% холдингов.Исторические источники описывают, что черный рис использовался только членами королевской семьи, а местная община Meitei использовала его только во время религиозных фестивалей и особых случаев (Borah et al., 2018). Среди риса Chakhao рис с глубоко пигментированными зернами в народе называют «черным рисом Манипур». Они обладают высоким содержанием антоцианов в околоплоднике, что придает им антиоксидантные свойства. Признавая их исключительное качество нутрицевтиков, в 2019 году правительство Индии присвоило черному рису Манипур статус географического указания (GI), зарегистрировав его под GI No.602 в Реестре географических указаний (Правительство Индии, 2019).

Есть несколько местных сортов ароматного риса Манипура, которые имеют общий эпитет Чахао , но остаются редко охарактеризованными. Более ранние исследования в разные периоды, проведенные в Манипуре, позволили собрать несколько таких местных сортов, которые хранятся в Национальном банке генов (NGB) Национального бюро генетических ресурсов растений (ICAR-NBPGR), Нью-Дели (Hore, 2005). В одном исследовании генетическое разнообразие 37 местных сортов чахао было оценено с использованием 40 микросателлитных (SSR) маркеров, чтобы выявить значительное генетическое разнообразие (0.673) с маркерами, имеющими значение PIC 0,63. Было обнаружено, что эти староместные сорта сгруппированы в шесть классов, тесно связанных с классификацией фермеров (Roy et al., 2014). О значительных вариациях также сообщалось по признакам, связанным с урожайностью, у десяти генотипов черного риса Манипура (Asem et al., 2019). По данным биохимического анализа Asem et al. (2015) показали, что основная фракция антоцианов генотипов черного риса, Chakhao Poireiton и Chakhao Amubi , была дельфинидин-3-галактозидом, при этом Chakhao Poireiton имел среднее содержание антоцианов 740 мг / кг и общее фенольное содержание. от 5 до 6 г / кг сухой муки.Позднее сообщалось о 26 ароматических соединениях из Chakhao Poireiton , а об 11 — из Chakhao Amubi (Asem et al., 2017). Другое исследование Chanu et al. (2016) подтвердили наличие высоких уровней антоцианов, полифенолов и цинка, обладающих значительной антиоксидантной активностью, у староместных сортов Чахао . Однако более ранние исследования страдали теми или иными недостатками, либо они проводились на ограниченном числе генотипов, либо характеризовались только морфологическими, биохимическими или молекулярными вариациями.Поэтому было сочтено необходимым провести всестороннее исследование для оценки различий между несколькими сортами риса Chakhao , включая репрезентативные местные сорта, с точки зрения агроморфологического, биохимического и молекулярного разнообразия. Нет сообщений о профилировании антоцианов и их вариациях между различными местными сортами с запахом черного, культивируемыми в Манипуре. Соответственно, настоящее исследование характеризует один из полных наборов зародышевой плазмы ароматических староместных сортов риса, происходящих из Манипура, включая черный рис, по фитохимическим свойствам, таким как пигментация, содержание антоцианов и антиоксидантной активности, а также агроморфологическим, молекулярным и зерновым качествам, таким как приготовление пищи. и аромат.

Материалы и методы

В исследовании использовались 93 образца зародышевой плазмы ароматического риса, собранные в различных частях Манипура, охватывающие как холмистые, так и долинные экосистемы (дополнительная таблица S1). Среди них 79 генотипов были получены из NGB, ICAR-NBPGR, Нью-Дели; семь были собраны с фермерских полей в Манипуре, а семь были получены от ICAR-Regional Center for North-Eastern Hill Region (ICAR-RC-NEH), в центре Манипура. Первоначально генотипы были сгруппированы на основе априорной информации о пигментации околоплодника, аромате и экологии адаптации (таблица 1).Наиболее контрастной особенностью исследуемого материала было их разнообразие пигментации колосков и околоплодников (рис. 1). Все генотипы были первоначально размножены в ИКАР-Индийском научно-исследовательском институте сельского хозяйства (ICAR-IARI), Нью-Дели, в течение Kharif 2017. В течение Kharif 2018 генотипы были выращены в регионе ICAR-RC-NEH, центр Манипура, в низинных богарных условиях. Каждый генотип выращивали в три ряда длиной 2,7 м с интервалом 20 см между рядами и 15 см между растениями.Полевой эксперимент был разработан в расширенном дизайне с четырьмя блоками и пятью неароматическими чеками, , а именно ., RC Maniphou 7, RC Maniphou 10, RC Maniphou 11, RC Maniphou 12 и RC Maniphou 13. Экспериментальный урожай был выращен. со стандартными агрономическими приемами для сохранения и сбора хорошего урожая. Послеуборочный анализ качества зерна, оценка антоциановых соединений и молекулярная работа проводились в Отделе генетики и Отделении сельскохозяйственных химикатов ICAR-IARI, Нью-Дели.

Таблица 1. Распределение ароматических генотипов на основе различных мест их происхождения в Манипуре, включено в панель генотипов, использованных в исследовании, на основе априорной информации , такой как цвет околоплодника, аромат, экосистема и местный имена.

Рис. 1. Вариация признаков зерна в репрезентативном наборе зародышевой плазмы ароматического риса из Манипура. Chakhao Angouba (MAR 67), Napnang Hangmei (MAR 31), Kabo Chakhao (MAR 93), Buhman (MAR 62), Buhman (MAR 59), Buhman (MAR 60) , Buhman Te (MAR 51), Chakhao Phou (MAR 42), Ethe Buw (MAR 77), Chakhao (MAR 17), Chakhao Amubi (MAR 69), Chakhao Poireiton ( МАР 70), Чахао Пурейтол (МАР 6), Чахао Пурейтон (30 МАР), Чахао (15 МАР).Обратите внимание, что генотипы с одинаковыми названиями сильно различаются по типам зерен.

Агро-морфологическая характеристика

Морфологические наблюдения проводились на пяти случайно выбранных однородных растениях в пределах каждой линии. Данные были записаны по 12 количественным признакам, включая агроморфологические признаки и признаки качества зерна, а также шесть качественных признаков, связанных с пигментацией. Агроморфологические признаки включали дни до пятидесятипроцентного цветения (DF), высоту растения (PH), количество метелок (PN), длину метелки (PL), массу 1000 зерен (GW) и урожайность отдельных растений (PY), в то время как Признаки качества зерна включали длину ядра (KL), ширину ядра (KW), отношение длины к ширине (LR), содержание амилозы (AC), коэффициент распределения щелочи (AS) и консистенцию геля (GC).Качественная морфологическая информация, такая как статус пигментации базального влагалища листа (BL), язычка (LG), ушной раковины (AU) и воротничка (CO), регистрировалась на стадии кущения как наличие / отсутствие, в то время как цвет lemma / palea (LP ) и околоплодник (PC) регистрировали при зрелости зерна по шкале от 1 до 9 в соответствии с рекомендациями по отличимости, однородности, стабильности (DUS) риса (Rani et al., 2006). Такие характеристики качества зерна, как содержание амилозы (Juliano, 1971), величина растекания щелочи (Cagampang et al., 1973) и консистенция геля (Little et al., 1958) были проанализированы в соответствии со стандартной системой оценки (SES) для риса (IRRI, 2013).

Оценка антоцианов, общих фенолов и антиоксидантной активности в зернах

Поскольку антоцианы накапливаются только в пигментированном рисе, оценка содержания антоцианов была ограничена подмножеством из тридцати пигментированных генотипов, в основном по номенклатуре Chakhao с черными, пурпурными или коричневыми зернами и двумя сортами с белыми зернами риса в качестве непигментированных. чеки. Для оценки соединений экстракт черного риса с высоким содержанием антоцианов (ABRE) получали из очищенных от коры зерен с использованием метода, описанного Sompong et al.(2011) с небольшими изменениями. Вкратце, очищенные от шелухи зерна риса тонко измельчали ​​в ступке путем ручного измельчения и хранили при 4 ° C. Около 100 мг муки экстрагировали 25 мл подкисленного метанола (HCl / метанол, 0,14% об. / Об.) В течение 30 минут при 40 ° C с обработкой ультразвуком два-три раза для обеспечения полной экстракции цвета. Экстракт центрифугировали при 8000 об / мин в течение 5 мин, супернатант полностью выпаривали на роторном испарителе (Heidolph Laborota 4001 effective, Германия) при 40 ° C.Экстракт восстанавливали в 5 мл подкисленной дистиллированной воды (0,14% об. / Об. Концентрированной HCl) и хранили в холодильнике при -20 ° C до дальнейшего анализа.

Идентификация и количественное определение антоциановых соединений

Идентификацию антоцианового соединения в зернах черного риса проводили с помощью ABRE из Chakhao Poireiton (MAR70) с помощью системы жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС) с масс-спектрометрией высокого разрешения Synapt G2 (Waters Corp., Милфорд, Массачусетс) в Центре передовых инструментальных исследований Университета Джавахарлала Неру, Нью-Дели. Образец элюировали смесью вода: метанол (90:10, об. / Об.) Со скоростью потока 0,1 мл / мин с использованием колонки BEH C18 размером 2,1 × 100 мм с размером частиц 1,7 мкм при температуре, поддерживаемой на уровне 25 ° C. Работая в одноквадрупольном режиме, ЖХ-МС использовала ионизацию электрораспылением (ESI). Прибор сканировал в диапазоне масс (m) / заряда (z) от 100 до 1100 в режиме положительных ионов ESI (Lee, 2010).

На основании выявленных антоциановых соединений в ЖХ-МС, общее содержание антоцианов было определено количественно в различных генотипах черного риса с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), как описано Ли (2010). Разделение антоциановых соединений проводили с помощью обращенно-фазового разделения на колонке C18 ODS Hypersil (Thermo Electron Corporation; 250 × 4,6 мм, 5 мкм). Хроматографический анализ выполняли на системе ВЭЖХ Waters ^® (модуль разделения Alliance 2695) с четверными насосами, автосэмплером и детектором с фотодиодной матрицей (КПК) 2996 и управляемым программным обеспечением Empower 2 для записи данных.

Подвижные фазы, состоящие из Растворителя A, содержащего воду, ацетонитрил и трифторуксусную кислоту (TFA) в соотношении 53: 46: 1, и Растворителя B, содержащего 0,1% TFA в воде, пригодной для ВЭЖХ (Singh et al., 2017), со временем выполнения 20 минут. Градиентная система растворителей с растворителем A (20: 60: 20: 20) и растворителем B (80: 40: 80: 80) при 0–7 мин, 7–11 мин, 11–16 мин и 16–20 мин, соответственно, использовалось для максимального разрешения. Скорость потока была установлена ​​на 600 мкл в минуту, а температура колонки была установлена ​​на 25 ° C.Элюирование соединений контролировали при длине волны 517 нм, и выбор пика осуществляли путем сравнения времени удерживания со стандартным соединением. Калибровочные кривые были получены для стандартных соединений антоцианов путем нанесения различных концентраций на площадь пика на хроматограмме. Путем сравнения времени удерживания и площади пика со стандартными соединениями было получено содержание антоциана в образце.

Количественное определение общих фенолов

Для определения общего содержания фенолов в ABRE использовался модифицированный анализ Фолина – Чокальтеу (Slinkard and Singleton, 1977; Saikia et al., 2012). Вкратце, водный раствор, состоящий из 100 мкл ABRE образца, 1,50 мл дистиллированной воды и 100 мкл реагента Фолина-Чокалтеу (2 н.), Хорошо перемешивали. Через 5 минут добавляли 300 мкл 20% карбоната натрия, хорошо перемешивали, покрывали серебряной фольгой и выдерживали при комнатной температуре в течение 60 минут. Контрольный образец был приготовлен аналогично, но путем замены разбавленной смеси образца дистиллированной водой. Оптическую плотность измеряли при 765 нм с помощью микропланшетного ридера Epoch 2 (Biotech R, США).Стандартная кривая была построена с использованием различных концентраций галловой кислоты (100, 200, 300, 400, 500 мкг / мл ^–1 ) из основного раствора 10 мг / мл ^–1 . Общее содержание фенолов рассчитывали по формуле (CxV) / W, где C — эквивалент галловой кислоты (GAE) образца (мг.мл ^–1 ), полученный по стандартной кривой, V — объем экстракта. в мл, W — вес образца (г). Общее содержание фенолов выражается в мг GAE на 100 г сухого веса (DW).

Антиоксидантная активность

Антиоксидантная активность ABRE была протестирована с использованием активности по улавливанию радикалов 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (DPPH) (RSA) (Brand-Williams et al., 1995). Свежий раствор DPPH (0,066 мМ) получали растворением 0,0026 г в 100 мл 95% метанола. 100 мкл экстракта образца добавляли к 2,9 мл свежеприготовленного раствора DPPH и инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин. Оптическую плотность измеряли с использованием спектрофотометра при 517 нм против метанола в качестве холостого опыта и 100 мкл 0.1% -ная подкисленная вода в 2,9 мл раствора DPPH в качестве контроля. RSA рассчитывали и выражали в процентах как [(A ₀ -A _s ) / A ₀ ] × 100, где A ₀ — оптическая плотность контроля, а A _s — оптическая плотность образца. извлекать.

Пигментация ядер риса

L ^∗ , a ^∗ и b ^∗ цветовые шкалы использовались для определения пигментации обесцвеченных образцов зерна с помощью системы колориметра Hunter-Lab (Miniscan ^® XE Plus 4500 L , Вирджиния, США).Значение L указывает уровень темноты (0–50) и яркости (51–100), шкала a положительного значения указывает красность, а отрицательное значение — зеленость, а шкала b указывает желтизну для положительное значение и голубизна для отрицательного значения. Все три значения требовались для полного описания цвета объекта (Hunter and Harold, 1987), а анализ цвета проводился, как описано Murdifin et al. (2015).

Характеристика молекулярной изменчивости с помощью микросателлитных маркеров

Для анализа генетического разнообразия использовалась панель из пятидесяти маркеров SSR, рекомендованных программой проверки поколения (GCP) Консультативной группы международных сельскохозяйственных исследований (CGIAR), обеспечивающей охват всего генома (Ali et al., 2011). В качестве проверяет вместе с 93 образцами зародышевой плазмы для оценки их генетического родства и кластеризации. Образцы листьев были собраны из индивидуального генотипа, и ДНК была извлечена с использованием метода бромида цетилтриметиламмония (CTAB) (Murray and Thompson, 1980).Амплификацию с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) проводили с 25 нг матричной ДНК, 5 пмоль каждого праймера и 2 × готовой к использованию мастер-смесью для ПЦР (Genei, Бангалор) в 10 мкл реакционной смеси. Параметры ПЦР-амплификации включали начальную денатурацию при 95 ° C в течение 5 минут, затем 35 циклов термического профиля, состоящего из 95 ° C в течение 30 с, специфической для маркера температуры отжига в течение 30 секунд, 72 ° C в течение 1 минуты и окончательное удлинение при 72 ° C в течение 10 мин. Ампликоны разделяли на 3,5% метафорагарозном геле, окрашенном бромидом этидия и визуализировали на GelDoc XR (Bio-Rad Laboratories Inc., Соединенные Штаты). Для сравнения размера аллеля использовали лестницу из 50 п.н.

Анализ данных

Количественные данные были протестированы на предмет описательной статистики и нормальности и проанализированы на предмет дисперсии с использованием программного обеспечения STAR (IRRI, 2014), работающего в среде R. Значимое тестирование проводится при минимальном уровне вероятности 95%. Данные были подвергнуты ассоциативному анализу, и некоррелированные переменные были использованы для определения морфологического разнообразия с использованием анализа главных компонентов.Данные маркеров были подвергнуты анализу разнообразия с использованием простого коэффициента соответствия (SMC) в качестве оценки генетического расстояния (Sokal and Michener, 1958). Матрица разнесения была подвергнута кластеризации с использованием метода невзвешенного объединения соседей с загрузкой 10 000 раз. Модель разнообразия была дополнительно определена для структуры популяции (Pritchard et al., 2000) с использованием Structure v.2.3.4 (Prichard et al., 2010), а генетическая статистика субпопуляций была разработана с использованием GenAlex v.6.5 (Peakall and Smouse, 2012).

Результаты

Изменчивость агроморфологических признаков

Частотный анализ ароматической зародышевой плазмы риса на основе признаков представлен на Рисунке 2. Большинство этих генотипов (66,7%) имели поздний срок цветения (DFF: 111–130 дней), высокие (> 130 см) с низким числом (<11 ) с более длинными метелками (26–30 см) и средней массой (21–25 г) - 1000 зерен. Наблюдения за пигментацией на различных частях растений риса (рис.3) показали, что 42 генотипа (45,2%) показали пурпурную пигментацию базального листа, 36 генотипов (38.7%) обладали пурпурным язычком, а 44 генотипа (47,3%) давали пурпурную ушную раковину и воротник. Преобладали лемма и палеа соломенного цвета, за которым следовала черная окраска. Оценка качества зерна показала, что большинство из них были длинными и тонкими, за ними следовала длинная жирная категория. Кроме того, большинство генотипов имели низкое содержание амилозы в сочетании с консистенцией мягкого геля и промежуточным значением распределения щелочи. Было обнаружено, что 26% генотипов обладали темно-фиолетовым околоплодником.

Рисунок 2. Распределение генотипов ароматического риса Манипура на основе агроморфологии и качества зерна по классам стандартной системы оценки (SES).

Рисунок 3. Распределение генотипов на основе фенотипических вариаций окраски зерна в зародышевой плазме ароматического риса Манипура.

Корреляция между различными агроморфологическими признаками (рис. 4) показывает, что PH и PL значительно положительно связаны, а KW значительно влияет на GW и GY.Среди характеристик качества приготовления GC отрицательно коррелировал с AC. Все параметры пигментации были отрицательно связаны с GW и GY. Было замечено, что пигментация вегетативных частей растений (BL, LG, AU и CO) значительно коррелировала с пигментацией семян (LP и PC).

Рис. 4. Корреляция между различными агроморфологическими признаками в зародышевой плазме ароматного риса Манипура. PH, высота растения в см; DF, дни до 50% цветения; PN — номер метелки; PL — длина метелки в см; GW, масса 1000 зерен в г; GY — урожай зерна с растения в г; KL, длина ядра в мм; KW, ширина ядра в мм; LR — отношение длины к ширине; AS — укрывистость щелочи; ГХ — консистенция геля; AC — кажущееся содержание амилозы в процентах; LG, пигментация язычка; AU — пигментация ушной раковины; СО — пигментация воротника; BL — базальная окраска листьев; LP, лемма и цвет палеи; ПК, околоплодник окраски.*, **, *** Значимо при уровнях вероятности 0,05, 0,01 и 0,001 соответственно.

Дисперсионный анализ (ANOVA) для различных агроморфологических признаков был оценен (таблица 2) между пигментированными (27) и нефиолетовыми группами (71) на основе экологии адаптации и регионов долины (58) и холмов (31). . Между двухцветными группами наблюдалась значительная разница по таким признакам, как PH, PL и GY. Генотипы темно-фиолетового цвета были выше и давали более длинные метелки и более низкий урожай зерна по сравнению с генотипами не темно-фиолетового цвета.Среди регионов генотипы долины были выше и обладали большей длиной метелки по сравнению с генотипами холма.

Таблица 2. Дисперсионный анализ различных агроморфологических признаков и признаков качества зерна в зародышевой плазме ароматического риса Манипура по классификации a priori , основанной на цвете околоплодника и адаптации экосистемы.

На основе анализа главных компонентов (PCA) с использованием всех агрономических признаков, пигментации и качества зерна были идентифицированы семь наиболее вариабельных фенотипических признаков, вносящих значительный вклад в общую фенотипическую изменчивость (дополнительная таблица S2).При использовании подмножества признаков на первые два основных компонента (ПК) приходилось 76% общей дисперсии (таблица 3), при этом на первый ПК приходилось 55% общей вариации. Основными переменными, способствовавшими возникновению первого ПК, были статус пигментации органов растений, а именно LG, CO, AU, PC, LP и BL. Второй главный компонент внес 21% от общей вариации и имел влияние AC, GC и PH. На биплоте PCA (рис. 5) генотипы четко распределены по PC1 и PC2. Большинство темно-пурпурных и белых генотипов околоплодника были сгруппированы отдельно в противоположных направлениях вдоль оси PC1, тогда как другие цветовые категории, такие как светло-коричневый, темно-коричневый, пестрый пурпурный и пестрый коричневый, были обнаружены разбросанными между ними.Аналогичным образом, высокорослый генотип MAR103 ( Chakhao Amubi ) (177,4 см) и карликовый генотип MAR43 ( Chakhao Phou ) (98,0 см) были размещены по диагонали напротив оси PC2. Генотипы с низким содержанием амилозы были обнаружены в сочетании с высокими значениями GC (MAR43, MAR57, MAR58), которые были четко отделены от генотипов с высокими значениями амилозы и низкими значениями GC (MAR94, MAR105).

Таблица 3. Основные компоненты, извлеченные из наиболее влиятельных фенотипических признаков зародышевой плазмы ароматного риса Манипура.

Рис. 5. Диаграмма PCA, показывающая разделение ароматической зародышевой плазмы Манипура с использованием большинства вариабельных фенотипических признаков. Было выделено три группы генотипов, сгруппированных по цвету околоплодника. Генотипы с белым околоплодником (светло-голубым) сформировали кластер 1, в то время как генотипы темно-фиолетового (пурпурного) цвета сформировали второй. Третья группа была промежуточной по сравнению с первыми двумя (коричневая). Зеленые стрелки показывают направление влияния черт. LG, пигментация язычка; AU — пигментация ушной раковины; СО — пигментация воротника; BL — базальная окраска листьев; LP, лемма и цвет палеи; ПК, околоплодник окраски; PH, высота растения в см; ГХ — консистенция геля; AC, содержание амилозы.

Изменение молекул на основе маркеров SSR

Из пятидесяти использованных маркеров SSR два маркера (RM 133 и RM 484) оказались мономорфными по всей зародышевой плазме и, следовательно, исключены из дальнейшего анализа. Сводная статистика 48 маркеров SSR представлена ​​в таблице 4. Всего был идентифицирован 171 аллель, в среднем 3,5 аллеля на маркер, в то время как количество аллелей на маркер варьировалось от 2 до 7. Максимальное количество аллелей на каждый маркер составляло семь. обнаружен с помощью RM 413, RM 552 и RM 144.Частота основного аллеля была самой низкой для RM 552 (0,206) и самой высокой для RM 454 (0,959) со средним значением 0,664 (дополнительная таблица S3). Разнообразие генов или ожидаемая гетерозиготность варьировались от 0,115 (RM125) до 0,826 (RM 552) со средним значением 0,443. Разнообразие на хромосомном уровне было максимальным для хромосомы 11 (0,624), а минимальное разнообразие наблюдалось в хромосоме 6 (0,281). Наибольшее значение PIC было получено для 552 ринггитов (0,802), а наименьшее — для 454 ринггитов (0,078) со средним значением 0,394. В этом исследовании были идентифицированы семнадцать редких аллелей с частотами менее 5% в образцах.Кроме того, также было 11 уникальных аллелей. Три из этих уникальных аллелей были обнаружены в генотипах MAR50, MAR51 и MAR58, каждый из которых имел Buhman как часть своего имени.

Таблица 4. Полиморфизм маркера и аллельный статус микросателлитных маркеров панели GCP среди ароматической зародышевой плазмы риса из Манипура.

Кластерный анализ с использованием молекулярных данных

Генетическое расстояние, оцененное с помощью SMC, между каждой парой генотипов, варьировалось от 0.08 и 0,86 со средним значением 0,47. Матрица несходства SMC для 98 генотипов, которая включала 93 ароматической зародышевой плазмы риса и пять контрольных линий, была использована для группировки генотипов в три основных кластера (рис. 6). Кластер I содержал 23 генотипа, разделенных на три подгруппы по 12, 5 и 6 генотипов, включая japonica , Basmati и aus проверки, соответственно. Большинство членов кластера I были из холмистой местности и обладали светло-коричневым околоплодником.Кластер II включал 73 генотипа, преимущественно выращенных в условиях долинной экологии. Он включал подгруппы пигментированных (темно-фиолетовый, пестрый коричневый, пестрый пурпурный), белого и светло-коричневого генотипов околоплодника. Кластер II также включал чек indica , IR64. Кластер III содержал только два генотипа Chakhao , MAR10 и MAR11, происходящие из региона долины.

Рис. 6. Иерархическая кластеризация генотипов ароматического риса из Манипура на основе маркеров SSR путем невзвешенного объединения соседей с использованием простых коэффициентов сопоставления, показывающих три различных кластера.

Структура популяции образцов ароматического риса из Манипура

Байесовский анализ популяционной структуры ароматного риса Манипура выявил три субпопуляции, на что указывает статистика ad hoc , ΔK (рис. 7). Субпопуляции POP1, POP2 и POP3 включали 12, 34 и 52 генотипа соответственно. Интересно отметить, что подгруппы кластера I из более раннего анализа разделились на две субпопуляции (POP1 и POP2). Члены каждой субпопуляции были далее разделены на чистые или смешанные на основе предполагаемых коэффициентов происхождения.Генотипы с коэффициентом = 0,95 считались чистыми, а с коэффициентами <0,95 считались примесью. Соответственно, POP1 содержал девять чистых генотипов, включая шесть горных образцов с белым и светло-коричневым околоплодником. Остальные члены этой группы включали староместный сорт « Maklei » с пестрым коричневым околоплодником, тропический чек japonica , IRGC3764 и чек умеренной зоны japonica , Taipei 309. Чек ароматической группы, Taraori Basmati, был сгруппированы вместе с чеком japonica , в POP1 в качестве примеси.Эти холмистые генотипы также были сгруппированы отдельно с помощью кластерного анализа. Они показали отчетливо различимый аллельный паттерн для двуаллельных маркеров, а именно RM 489, RM 338, RM 161, RM 455 и RM 284 из других генотипов. POP2 включал 12 генотипов в виде чистых типов и 22 генотипа в виде примесей, включая indica, check, IR64 и aus check, Nagina 22. Эти генотипы либо принадлежали регионам холмов и долин, либо в основном имели белый и светло-коричневый околоплодник.В эту субпопуляцию были включены два генотипа Chakhao , MAR10 и MAR11, которые сформировали кластер III. POP3, самая большая субпопуляция, включала 29 генотипов в чистом виде и 23 генотипа в качестве примесей. Большинство генотипов (22) в чистой категории были темно-пигментированными (темно-пурпурный, пестрый пурпурный / коричневый) как из долинных, так и из холмистых регионов.

Рисунок 7. Популяционная структура зародышевой плазмы ароматного риса из Манипура. Три субпопуляции были разделены по наивысшему значению ΔK (см. Выше).Среди субпопуляций POP1 показал большее отличие от двух других. POP1 также был группой, в которой не было генетической примеси. POP2 и POP3 имеют большой набор примесей.

Анализ молекулярной дисперсии (AMOVA) выявил значительные различия между полученными субпопуляциями и внутри них (Таблица 5). Среди субпопуляций было обнаружено отклонение в 23%, однако внутри субпопуляций было получено 77% отклонение среди отдельных лиц. Никаких внутриличностных вариаций обнаружено не было. Специфичные для популяции F _st из трех субпопуляций были равны 0.260, 0,401 и 0,106, соответственно, со средним значением 0,256, указывающим на более высокий уровень генетической дифференциации.

Таблица 5. Анализ молекулярной дисперсии (AMOVA) и статистика дифференциации популяций среди субпопуляций панели ароматического риса Манипура.

Количественная оценка антоцианов, полифенолов и антиоксидантной активности

В ARBE Chakhao poireiton (MAR70) масс-спектрометрией были обнаружены два пика при m / z 449.1 и 463,1, соответствующие C3G и P3G, соответственно, вместе с двумя основными пиками 287,05 и 301,07 (фиг. 8), которые можно идентифицировать как цианидин и пеонидин, агликоны. Также были обнаружены незначительные пики, которые нельзя было идентифицировать из-за их очень низкой концентрации в экстракте. Впоследствии их количественно определяют как эквиваленты цианидин-3-глюкозида (C3GE). Основные фракции антоцианов были дополнительно подтверждены хроматографически по их времени удерживания (RT) 11,95 мин для C3G и 12.9 мин для P3G, согласно соответствующим стандартам (дополнительная таблица S4). Были также незначительные пики при более низких RT, которые не идентифицированы. Количественная оценка антоцианов от тридцати генотипов, идентифицировавших C3G как основную фракцию антоцианов, сопровождалась P3G (рис. 8). Среди генотипов с черным пигментом наблюдался значительный разброс по общему количеству антоцианов, который находился в диапазоне от 29,8 до 275,8 мг 100 г ^–1 (Таблица 6). Генотипы с похожими названиями, такие как Chakhao Poireiton , Chakhao Amubi и Ching Chakhao , собранные из разных мест, показали значительные различия в общем содержании антоцианов и его составляющих (Таблица 6).Среднее содержание C3G (113,3 мг 100 г ^-1 ) среди генотипов было почти в шесть раз выше среднего содержания P3G (19,7 мг 100 г ^-1 ) и в семь раз выше, чем C3GE (16,2 мг 100 г ^{— 1} ). В среднем процентное содержание C3G, P3G и C3GE составляло 76, 13 и 11 соответственно. Было обнаружено, что общее содержание фенолов значительно различается между генотипами белого (56,0 мг GAE.100g ^–1 DW) и черного (339,2 мг GAE.100g ^–1 DW) риса.RSA (%) с помощью анализа DPPH показывает значительные различия между белыми (в среднем 7%) и пигментированными генотипами (в среднем 38%). Интересно, что среди пигментированных генотипов минимальные (17,7) и максимальные (65,7) значения RSA (%) наблюдались у темно-фиолетовых генотипов: Ching Chakhao Amubi (MAR1) и Chakhao (MAR 91) соответственно.

Рис. 8. Идентификация антоцианов в сорте черного риса Манипур Chakhao Poireiton. МС-спектры, показывающие (A) фрагментов цианидин-3-о-глюкозида (C3G), (B) фрагментов пеонидин-3-о-глюкозида (P3G).Количественное определение идентифицированных антоцианов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (C) Хроматограмма Chakhao Poireiton со стандартными пиками C3G и P3G на вставках.

Таблица 6. Изменение общего количества антоцианов, общего количества фенольных соединений, активности по улавливанию радикалов и цветовых шкал в ядрах тридцати пигментированных староместных сортов риса по сравнению с двумя генотипами белого риса из Манипура.

По-видимому, значения цвета L ^∗ и b ^∗ были выше у белых генотипов по сравнению с генотипами с глубоким черным пигментом.Значение b ^* было отрицательным в глубоко пигментированных генотипах. Параметр a ^∗ , отражающий красноту и зелень, был выше в генотипах с низким содержанием антоцианов (коричневый) по сравнению с генотипами с белыми и темно-пурпурными пигментами.

Взаимосвязь характеристик пигментации и нутрицевтических свойств

Общее содержание антоцианов, содержание C3G, содержание P3G и содержание C3GE были достоверно положительно связаны с общими фенольными соединениями и RSA (рис. 9).Содержание антоцианов было высоким в темно-фиолетовых генотипах, в основном Chakhao и Chakhao Poireiton , по сравнению с темно-коричневыми или пестро-пурпурными генотипами, которые были пигментированы на дорсальной стороне семенного ядра. Однако некоторые из темно-пурпурных генотипов (MAR 6, MAR 85) с высоким содержанием антоцианов обладали относительно меньшим количеством общих фенольных соединений по сравнению с генотипами с более низким содержанием антоцианов (MAR 70 и MAR 69) и , наоборот, . Однако составляющие антоцианов C3G и P3G показали положительную связь с RSA; некоторые из генотипов с одинаковым общим содержанием антоцианов (MAR 70, MAR 69 и MAR 36), но с более высокой долей C3G (MAR 36) показали более высокий RSA (%).Все цветовые шкалы ( L ^∗ , a ^∗ , b ^∗ ) имели значительную отрицательную связь с изученными фитохимическими параметрами. В рамках цветовых шкал L ^∗ , изображающие светлые и темные цвета, показали вариации в пределах пигментированных генотипов, где темно-фиолетовые генотипы показали значения ниже 20, тогда как темный / пестрый коричневый рис имел значения от 20 до 25 по сравнению с генотипами белого риса с> 30. Значение b ^∗ в темно-пурпурных генотипах было либо отрицательным, либо меньшим значением (<3), отображающим голубизну (-), за исключением Ching Chakhao Amubi (MAR 1 с> 3).Белые и пестрые коричневые генотипы показали более высокое положительное значение (> 5), отражающее желтизну. Значение цветовой шкалы a ^∗ , отображающее покраснение (+), было низким для белых генотипов, а также для темно-фиолетовых генотипов и выше для темных / пестрых коричневых генотипов. Шкалы L ^∗ и b ^∗ были сильно положительно коррелированы друг с другом, тогда как связь между L ^∗ и a ^∗ была несущественной.Все цветовые шкалы были отрицательно связаны с оцененными фитохимическими веществами.

Рис. 9. Взаимосвязь между содержанием антоцианов, нутрицевтическими свойствами и цветовой шкалой CIELAB среди тридцати генотипов черного риса из Манипура. ТА, общее содержание антоцианов в мг на 100 г ^{— 1} DW; C3G, цианидин-3-о-глюкозид в мг 100 г ^{— 1} DW; P3G, пеонидин-3-о-глюкозид в мг 100 г ^{— 1} DW; C3GE, цианидин-3-о-глюкозидный эквивалент в мг 100 г ^{— 1} DW; TP, общие фенольные соединения в мг эквивалента галловой кислоты (GAE) 100 г ^{— 1} DW; RSA — активность по улавливанию радикалов в процентах; L *, a * и b * — цветовые шкалы CIELAB.*, **, *** Значимо при уровнях вероятности 0,05, 0,01 и 0,001 соответственно.

Группирование пигментированных генотипов на основе PCA с данными о пигментации выявило два основных PC, на которые приходится 83,2% общей вариации, при этом PC1 и PC2 объясняют 70 и 13% общей вариации, соответственно. PC1 в основном определялся антоцианами (52%), фенолами (13,66%) и RSA (14,1%). PC2 в основном находился под влиянием цветовых параметров L ^∗ , b ^∗ и a ^∗ , составляющих 40.5, 34,2 и 9,7% соответственно. Диаграмма PCA четко поместила менее / непигментированные генотипы, включая категории темно-коричневого (1), пестрого коричневого (4) и белого (2) риса, отдельно от основных генотипов темно-фиолетового риса (дополнительный рисунок S1).

Обсуждение

Генотипы ароматного риса из северо-восточной Индии, особенно из Манипура, являются относительно менее известными сортами из-за их ограниченного выращивания в рамках их географической адаптации. Недавний интерес к их кулинарным и нутрицевтическим свойствам, особенно к черному рису из Манипура, привлек внимание ученых, занимающихся рисом, к пониманию генетики этих генотипов.Известные под своими народными названиями сорта с эпитетом Chakhao — chak означает «рис», а ahaoba означает «вкусный» (Dayanidhi et al., 2017) — это конгломерация местных местных сортов, которые имеют схожий аромат зерна. а также кулинарные и вкусовые качества, но генетически разные. Ароматный клейкий Chakhao с черным околоплодником преимущественно выращивают в долинных районах Манипура. Черный рис Манипура имеет долгую историю исключительного украшения королевской кухни и очень ограниченного использования за пределами аристократии, а его кулинарные свойства были менее известны до недавнего времени.Недавние исследования черного пигментированного риса в целом установили его диетическое значение, особенно по нутрицевтическим свойствам (Goufo and Trindade, 2014; Samyor et al., 2017). Тем не менее, генетическая идентичность ароматных рисов Манипура, особенно черного риса, должна быть установлена ​​для реализации их потенциального использования. Следовательно, существует неотложная необходимость охарактеризовать их генетическое разнообразие и использовать их для генетического улучшения, а также сохранить их для потомков будущих поколений.

Агроморфологическая характеристика для оценки генетического разнообразия сельскохозяйственных культур создает основу для генетического улучшения. У риса высота растения, продолжительность урожая и урожайность зерна являются тремя основными агрономическими параметрами, используемыми для определения урожайности, в то время как вторичные характеристики, такие как длина метелки, количество зерен, вес зерна, цвет и форма зерна, используются для классификации и идентификации (Bhandari et al. др., 2017). Несмотря на ограниченность, предыдущие исследования староместных сортов риса Chakhao Манипура проводились с использованием меньшего количества генотипов и меньшего количества признаков (Roy et al., 2014; Asem et al., 2015; Chanu et al., 2016). Наш анализ пытается восполнить этот пробел, охарактеризовав более широкий набор ароматических староместных сортов по агроморфологическим характеристикам, качеству варки зерна, пигментации и антиоксидантным свойствам. perties, а также на молекулярном уровне. Мы не обнаружили четкой связи каких-либо признаков с названиями староместных сортов. Напротив, мы могли обнаружить, что староместные сорта с одинаковыми эпитетами значительно различались по большинству оцениваемых признаков. Однако ароматические генотипы с глубокой окраской околоплодника значительно различались по высоте растений, длине метелки и урожайности зерна с растения.В целом, среди манипурского риса наиболее широко использовался эпитет Chakhao . В нашем исследовании было 69 местных сортов, которые носили название Chakhao или его близкие диалектические варианты, такие как Chakhao и Chahou . Среди них было 12 староместных сортов, которые имели название Chakhao Poireiton или его близкое к нему название Chakhao Poireitol . Однако 24 генотипа назывались только Chakhao . Кроме того, было десять сортов с суффиксом Amubi и семь с суффиксом Angouba .Выдающиеся сорта, такие как Chakhao Poireiton , обычно имели сильно ароматное темно-фиолетовое / черное ядро, с высоким ростом, длинными метелками и низким урожаем зерна. Сорта Chakhao Angouba были белого цвета с умеренным запахом, а сорта Chakhao Amubi включали все категории окраски околоплодника, от светло-коричневого, пестрого коричневого до темно-фиолетового. Бухман было вторым известным названием среди местных сортов на панели, с 16 сортами, носящими это имя.В то время как староместные сорта из долин в основном имели приставку « Чахао », староместные сорта из горных районов носили такие названия, как « Бухман » (Чурачандпурский район), « Маклей » (Ухрульский район) и « The Вумну »(Чандельский район). Большинство генотипов светло-коричневого околоплодника происходит из горных районов. Генотипы из горных районов значительно отличались от генотипов долин по высоте растений и длине метелки. Независимо от экологии коллекции и окраски околоплодника зерна староместных сортов были низкоамилозными, большинство из них с длинными тонкими зернами.Традиционное предпочтение местной общины Манипура — клейкий рис с мягкими качествами приготовления. Они используются исключительно в препарате kheer под названием Chakhao Thongba . Chanu et al. (2016) также наблюдали низкий уровень амилозы у двух основных сортов, а именно, Chakhao Poireiton и Chakhao Amubi . Они также обнаружили, что эти два сорта богаты пищевыми волокнами, белками и минералами по сравнению с популярным сортом риса Сона Машури, выращиваемым на юге Индии.Другое исследование, в котором оценивали качество зерна 10 ароматных риса вместе с тремя неароматическими местными сортами Манипура, показало, что большинство из них обладали длинными жирными меловыми зернами с высоким ASV и содержанием амилозы от низкого до среднего (Thongbam et al., 2010). Наше исследование показало, что староместные сорта были низкоурожайными, демонстрировали высокую стерильность колосков, дробили зерно и были светочувствительными (данные не представлены). Поскольку большинство этих местных сортов сохраняется и выращивается на соответствующих участках сбора, чтобы удовлетворить потребности социальных ритуалов, а не для натурального хозяйства, не было предпринято серьезных попыток их систематического генетического улучшения.Кроме того, на протяжении десятилетий площадь ароматного риса Манипура сокращалась, и фермеры предпочитали не выращивать эти староместные сорта из-за их очень низкой урожайности (Borah et al., 2018). Если эта тенденция сохранится, это может привести к генетической эрозии этих ценных местных местных сортов. В качестве альтернативы, благодаря таким преимуществам, как нутрицевтические свойства, пигментация, клейкий эндосперм и аромат, пигментированный рис набирает популярность среди потребителей во всем мире. Кроме того, мы обнаружили, что некоторые из староместных сортов также обладают такими желательными качествами, как скороспелость и относительно более высокий урожай зерна, что дает широкие возможности для улучшения урожая.Для систематического улучшения ароматического риса Манипур как по урожайности, так и по качеству желательно создать профиль желательных характеристик в рамках этого генофонда, таких как пигментация ядра и антиоксидантные свойства, а также нежелательные характеристики, такие как светочувствительность, растрескивание семян, низкий уровень колосков. плодородие и низкая урожайность.

Анализ вариаций в масштабе генома с использованием молекулярных маркеров — одно из средств определения эволюционных взаимоотношений между генотипами, которые, как считается, имеют общее происхождение.SSR очень полезны при оценке разнообразия среди близкородственных сортов риса (Singh et al., 2013; Yadav et al., 2013), поскольку они обеспечивают лучшую разрешаемость, являются мультиаллельными, обеспечивают охват всего генома, хорошо воспроизводятся, легко воспроизводятся. набирать очки и быть рентабельными (Akagi et al., 1997; Singh and Singh, 2015). Существует несколько исследований, в которых для определения генетической структуры зародышевой плазмы риса использовались SSR-маркеры как один из наиболее широко используемых молекулярных маркеров для исследований генетического разнообразия (Nachimuthu et al., 2015; Сингх и др., 2016; Aljumaili et al., 2018; Ислам и др., 2018а, б; Pathaichindachote et al., 2019; Суви и др., 2019; Верма и др., 2019). Кроме того, SSR-маркеры также доказали свою эффективность в определении основных генетических групп риса, а именно: indica , умеренный климат japonica , тропический japonica , aus и ароматический (Roy et al., 2015, 2016; Wang et al., 2014). В настоящем исследовании панель из 48 использованных маркеров SSR могла установить образец разнообразия в зародышевой плазме ароматического риса Манипура.Хотя разнообразие генов (0,443), а также значение PIC (0,394) были ниже, чем те, которые наблюдались в предыдущих исследованиях (Das et al., 2013), это можно объяснить узким экологическим диапазоном, из которого были получены линии, поскольку а также к большему количеству генотипов, протестированных в этом исследовании. Тем не менее, значительный уровень генетической изменчивости, наблюдаемой внутри линий, может быть связан с их долгой историей эволюции в конкретных экологиях. В настоящем исследовании была сделана попытка классифицировать ароматные староместные сорта риса на экотипы риса индика , тропический и умеренный климат и aus и их примеси на основе молекулярных данных.Гермоплазма содержала три субпопуляции с проверками, распределенными в первых двух субпопуляциях. Как и ожидалось, генотипа индика (POP2) преобладали по количеству типов японской (POP1) и обладали большим количеством примесей. Холмистые образцы больше относились к типу japonica (POP1) и имели очень меньшее количество примесей. Это указывает на то, что даже несмотря на то, что существовало давление популяции, исходящее от большинства подтипов indica , типы japonica сохранили свою генетическую идентичность среди ароматической зародышевой плазмы Манипура.Ранее Рой и др. (2016) сообщили о преобладании japonica и их примесей среди холмистого риса северо-востока Индии. POP2 включает такие генотипы, как MAR16, MAR51, MAR54, MAR57, MAR58, MAR68 и MAR98, которые обладают большинством редких и уникальных аллелей как из регионов холмов, так и долин. Пигментированный рис сформировал отдельную крупную субпопуляцию (POP3) среди протестированных генотипов. Происхождение черного риса Манипура может быть связано с завозом риса japonica из Китая, начиная со второго века до нашей эры (Tensuba, 1993; Singh and Baghel, 2003; Lalit, 2007).Заметными среди членов POP3 были староместные сорта чахао , которые включали как пигментированные, так и непигментированные типы. Наше исследование также показало, что пигментированный рис показал значительные различия в содержании фитохимических веществ, таких как антоцианы и фенолы, что означает, что староместные сорта Чахао подверглись изолированной консервации в местных хозяйствах. Поскольку было обнаружено, что RSA сильно коррелирует с параметрами цвета, эти линии также обладали высокими антиоксидантными свойствами в рисовом зерне.

Ранее анализ генома 21 староместного сорта черного риса показал, что происхождение гена черного риса произошло в тропическом регионе japonica , который позже мигрировал в indica , а затем в умеренный климат japonica (Oikawa et al., 2015). Признак кросс-подвидовой миграции признака черного риса также можно увидеть в настоящем исследовании, в котором один староместный сорт Маклей (темно-коричневый) из горного района Ухрула был сгруппирован вместе с типом japonica , тогда как остальные староместные сорта черного риса были сгруппированы в кластере подгрупп индика .Однако это наблюдение необходимо дополнительно подтвердить, взяв больше ссылок на соответствующие подгруппы и оценив разнообразие с помощью высокоплотных полногеномных маркеров. Кроме того, подкрепляя теорию кросс-подвидовой миграции, основанную на структуре популяции, мы могли идентифицировать субпопуляцию (POP3) с преобладанием генотипов с темно-фиолетовым околоплодником, а также для генотипов, адаптированных к холмам и долинам. Однако Рой и др. (2014) сообщили о шести подгруппах, таких как Chakhao Poireiton , Chakhao Amubi , Chakhao, Maklei , Buhman и Chakhao Angouba в 37 Chakhao староместных сортах, которые могли быть связаны с 47 случайными маркерами SSR. ограниченному количеству генотипов, использованных в исследовании.

Пигментация риса связана с накоплением антоцианов в околоплоднике зерен. Антоцианы представляют собой подгруппу флавоноидов, которые представляют собой водорастворимые пигменты, придающие различные оттенки красного, синего, пурпурного цветов частям растений. Они относятся к классу вторичных метаболитов группы полифенолов. В настоящем исследовании было обнаружено, что C3G и P3G являются преобладающими антоциановыми соединениями, в то время как неидентифицированная фракция была количественно определена как соединения C3GE. Идентификация была основана на масс-спектральных значениях, представленных как отношение m / z.Агликоны, цианидин и пеонидин, имеют значение am / z 287,05 и 301,07, соответственно (Abdel-Aal et al., 2006; Kim et al., 2008; Lee, 2010), что при добавлении сахарного фрагмента глюкоза (m / z: 162,00), делает общее m / z 449,1 и 463,1, соответствующими C3G и P3G. В нашем спектре соответствующие сигналы были идентифицированы как заметные пики, подтверждающие присутствие C3G и P3G. Присутствие как фракционированных, так и нефракционированных остатков служило подтверждением результата.Об идентификации аналогичных соединений ранее сообщалось от сортов черного риса Heugjinjubyeo (Lee, 2010) и Kilimheugmi (Ryu et al., 1998) из Кореи и черного риса в Китае (Sompong et al., 2011). Hou et al. (2013) идентифицировали составляющие фракции C3GE из сорта черного риса japonica , Longjing No. 1 в Китае, как цианидин-3,5-диглюкозид и цианидин-3-рутинозид. Среди японского черного риса Chen et al. (2012) идентифицировали четыре разных антоциана, таких как C3G, P3G, мальвидин и петунидин-3-O-глюкозид (Pt-3G).Asem et al. (2015) сообщили о дельфинидин-3-галактозиде, дельфинидин-3-арабинозиде, цианидин-3-галактозиде и C3G из Chakhao Poireiton . Кроме того, они также идентифицировали первые три из этих соединений в Chakhao Amubi . Однако идентификация этих соединений в их исследовании была основана на сравнении времени удерживания (RT), о котором сообщалось в более ранних публикациях, что является очень субъективным по своей природе, что приводит к возможности ошибок из-за изменений в системе растворителей и условиях оборудования. оценка.

Общее количество антоцианов среди староместных сортов риса в настоящем исследовании широко варьировало, придавая зернам различные оттенки цвета. Интересно отметить, что генотипы, имеющие один и тот же эпитет (ы) в составе своих имен, таких как Chakhao Poireiton , Chakhao Amubi и Ching Chakhao , но которые были собраны в разных местах в Манипуре, значительно различались по общему количеству антоцианов. содержание и его составляющие. Не было значительных различий в паттернах между генотипами из горных и долинных районов.Хотя сообщается, что на содержание антоцианов влияет окружающая среда (Somsana et al., 2013), в настоящем исследовании генотипы были равномерно выращены на экспериментальных участках в районе долины (Имфал), и, следовательно, различия между разными линии могли быть чисто генетическими. Кроме того, пигментация не влияла на адаптацию генотипа к разным экологическим условиям. Однако любое влияние развития околоплодника, толщины семенной оболочки, формы зерна и веса на накопление антоцианов и интенсивность окраски пигментированного риса Манипура требует дальнейших подробных исследований.Шен и др. (2009) сообщили, что содержание флавоноидов и фенолов положительно связано с формой зерна и отрицательно с массой зерна. Аналогичным образом, мы также могли наблюдать, что интенсивность пигментации зависела от пропорции и содержания пигментных соединений, начиная от светлого цвета до темного. Глубоко пигментированные зерна риса кажутся черными и обычно продаются как черный или фиолетовый рис. Нутрицевтические свойства пигментированного риса и их потенциальная польза для здоровья были установлены с использованием клеточных линий, животных моделей и клинических испытаний на людях (Pojer et al., 2013; Дас и др., 2014; Samyor et al., 2017; Khoo et al., 2017; Seechamnanturakit et al., 2018; Тануджа и Паримавалли, 2018; Каллкотт и др., 2019; Limtrakul et al., 2019).

Традиционно фиолетовый или черный рис выращивают и потребляют во многих азиатских странах, таких как Китай, Таиланд, Шри-Ланка, Республика Корея, Вьетнам, Индонезия, Индия, Филиппины и Япония. В Индии популярные сорта черного риса включают рис Чахао из Манипура и Калабхат из Западной Бенгалии.Содержание антоцианов в черном рисе из Кореи достигало 493 мг. 100 г ^–1 , при этом большая доля C3G варьировалась от 80 до 95,3% (Ryu et al., 1998), в то время как Lee (2010) сообщил о содержании C3G. от 52,1 ± 6,3 до 1601,0 ± 8,5 мкг г ^–1 и содержание P3G от 0,0 до 82,6 ± 1,2 мкг г ^–1 . Антоцианы, являющиеся составной частью полифенолов в растениях, общее содержание фенолов значительно коррелирует с содержанием антоцианов, особенно в пигментированном рисе (Dai and Mumper, 2010; Deng et al., 2013).

Способность антиоксидантных соединений улавливать радикалы обеспечивает огромную пользу для здоровья за счет улавливания активных форм кислорода (АФК) и других вредных свободных радикалов при возникновении окислительного стресса (Dröge, 2002). Когда клеточный аппарат не может сдержать стресс, антиоксиданты, такие как антоцианы, могут предотвратить повреждение, задерживая окислительный процесс или удаляя лишние свободные радикалы. Однако антиоксидантные свойства разных антоцианов различаются в зависимости от их молекулярной структуры.Активность возрастает с увеличением количества свободных гидроксильных групп вокруг пиронового кольца (Miguel, 2011). Среди наиболее распространенных антоцианов цианидин является наиболее активным в отношении супероксида после дельфинидина. В настоящем исследовании было обнаружено, что C3G является преобладающим антоциановым пигментом у местных сортов Chakhao , который может играть важную роль в улавливании супероксидов. RSA пигментированного риса был значительно выше, чем у непигментированных генотипов, от более чем двух до восьми раз.Chanu et al. (2016) сообщили о РСА 72,5% в Chakhao Poireiton и 59,0% в Chakhao Amubi . Хотя RSA, идентифицированный в этом исследовании, был немного меньше этих значений, мы могли наблюдать максимальную активность 65,7% в нашей панели. Однако наличие большого разброса в свободном RSA по сравнению с общим антоцианом , наблюдаемым в различных темно-фиолетовых генотипах со схожими эпитетами, требует определения базовых значений качества зерна и нутрицевтических стандартов, способствующих улучшению и продвижению этого особого риса.

Заключение

В настоящем исследовании мы выявили большой разброс по агроморфологическим характеристикам, качеству зерна, пигментации и фитохимическим характеристикам у ранее не охарактеризованных ароматических староместных сортов риса Манипура. Хотя у некоторых из них были общие эпитеты, мы обнаружили, что они значительно разнообразны и имеют общую принадлежность к отдельным субпопуляциям на основе генетических данных. Несмотря на общность названий, среднее генетическое разнообразие местных сортов составляло 0,443, что свидетельствует об их генетической уникальности.Это требует усилий по сохранению, документированию и использованию этого разнообразия для дальнейшего улучшения. Отличительной особенностью ароматного риса Manipur является изменение пигментации околоплодника от белого до темно-пурпурно-черного цвета. Некоторые из пигментированных генотипов имеют низкое содержание амилозы, мягкие кулинарные качества и высокое содержание антоцианов. Две растущие ниши в области , а именно ., Долина и холм, также демонстрируют отчетливую картину характеристик генотипа. Детальное исследование с использованием высокопроизводительных маркеров, таких как однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), обеспечивающих высокую плотность охвата всего генома, может помочь в оценке генетического родства этих генотипов с подтипами indica и japonica , а также для добычи романа. аллельные варианты, которые могут присутствовать в этом генофонде.Также существует потребность в оценке качества зерна посредством метаболического профилирования, количественной оценки аромата и содержания питательных микроэлементов, что может заложить прочную основу для сохранения и улучшения in situ этих уникальных местных сортов из Манипура.

Все наборы данных, представленные в этом исследовании, включены в статью / Дополнительные материалы.

Авторские взносы

AS и SG концептуализировали идею и руководили экспериментами.SB, SG и NS: провели молекулярную работу. SB, HB и SS проводили и контролировали качество, фитохимические оценки. РЭ, КВ и СБ провели статистический анализ. SB, IS, NP, PB и MN проводили и контролировали полевые эксперименты. С.Б., К.В. и С.Г. подготовили рукопись. Все авторы прочитали и одобрили окончательную рукопись.

Финансирование

Это исследование было поддержано Национальным проектом сельскохозяйственного высшего образования (NAHEP), финансируемым Всемирным банком и Индийским советом сельскохозяйственных исследований, через его Центр передовых сельскохозяйственных наук и технологий (CAAST) по теме «Селекция с помощью геномики для улучшения сельскохозяйственных культур» для ICAR-IARI, Нью-Дели.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Семенной материал, предоставленный Национальным банком генов, ICAR-NBPGR, Нью-Дели, и фермерами Манипура для исследования, выражен с благодарностью.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https: // www.frontiersin.org/articles/10.3389/fgene.2020.570731/full#supplementary-material

Сноски

Список литературы

Абдель-Аал, Э. М., Янг, Дж. К., и Рабальский, И. (2006). Состав антоцианов в черных, синих, розовых, пурпурных и красных зернах злаков. J. Agric. Food Chem. 54, 4696–4704. DOI: 10.1021 / jf0606609

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Акаги, Х., Йокозеки, Ю., Инагаки, А., и Фудзимура, Т.(1997). Высокополиморфные микросателлиты риса состоят из повторов AT и классификации близкородственных сортов с этими микросателлитными локусами. Теор. Прил. Genet. 94, 61–67. DOI: 10.1007 / s001220050382

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Али, М. Л., Мак-Клунг, А. М., Джиа, М. Х., Кимбалл, Дж. А., Маккач, С. Р., и Эйзенга, Г. К. А. (2011). Панель разнообразия риса оценивалась на предмет генетического и агроморфологического разнообразия между субпопуляциями и его географического распределения. Урожай. Sci. 51, 2021–2035. DOI: 10.2135 / crosci2010.11.0641

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Альджумаили, С. Дж., Рафии, М. Ю., Латиф, М. А., Сакимин, С. З., Аролу, И. В., и Миа, Г. (2018). Генетическое разнообразие зародышевой плазмы ароматного риса, выявленное по SSR-маркерам. Biomed. Res. Int. 2018: 7658032. DOI: 10.1155 / 2018/7658032

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Асем, И., Аманда, Н., Шахин, К., Нанита, Х., Юрембам Р., Асем Р. и др. (2019). Фенотипическая характеристика, генетическая изменчивость и исследования корреляции среди десяти ароматных рисов Чахао из Манипура. Внутр. J. Curr. Микробный. Прил. Sci. 8, 612–618. DOI: 10.20546 / ijcmas.2019.802.070

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Асем, И. Д., Имотомба, Р. К., и Мазумдер, П. Б. (2017). «Глубокий фиолетовый цвет и аромат — два великих качества черного ароматного риса (Чахао) из Манипура», в Advances in International Rice Research , ed.Дж. К. Ли (Лондон: Intech Open), 125–136. DOI: 10.5772 / 67193

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Асем И. Д., Имотомба Р. К., Мазумдер П. Б. и Лайшрам Дж. М. (2015). Содержание антоцианов в черном ароматном рисе (Чахао): его влияние на здоровье человека и защиту растений. Симбиоз 66, 47–54. DOI: 10.1007 / s13199-015-0329-z

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бхандари, Х. Р., Бхану, А. Н., Шривастава, К., Сингх, М. Н., Шрейя, и Хемантаранджан, А.(2017). Оценка генетического разнообразия сельскохозяйственных культур — обзор. Adv .. Plants Agric. Res. 7, 279–286. DOI: 10.15406 / apar.2017.07.00255

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бора Н., Атокпам Ф. Д., Семвал Р. и Гаркоти С. С. (2018). Чахао (черный рис. Oryza sativa L .): Культурно важный и устойчивый к стрессам традиционный сорт Манипура. Indian J. Tradit. Знать. 17, 789–794.

Google Scholar

Brand-Williams, W., Кувелье, М. Э., и Берсет, К. (1995). Использование свободнорадикального метода для оценки антиоксидантной активности. Lebenson Wiss. Technol. 28, 25–30. DOI: 10,1016 / s0023-6438 (95) 80008-5

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Каллкотт, Э. Т., Бланшар, К. Л., Снелл, П., и Сантакумар, А. Б. (2019). Противовоспалительные и антиоксидантные эффекты острого употребления пигментированного риса у людей. Food Funct. 10, 8230–8239. DOI: 10.1039 / C9FO0 ‘

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чану, К.С., Енаги, Н. Б., Математик, К. К. (2016). Пищевая и функциональная оценка генотипов черного риса. J. Farm. Sci. 29, 61–64.

Google Scholar

Чен, X.Q., Нагао, Н., Итани, Т., и Ирифуне, К. (2012). Антиоксидантный анализ, идентификация и количественная оценка антоциановых пигментов в разноцветном рисе. Food Chem. 135, 2783–2788. DOI: 10.1016 / j.foodchem.2012.06.098

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дас, Б., Сенгупта, С., Парида, С. К., Рой, Б., Гош, М., Прасад, М., и др. (2013). Генетическое разнообразие и структура населения староместных сортов риса из восточных и северо-восточных штатов Индии. BMC Genet. 14:71. DOI: 10.1186 / 1471-2156-14-71

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дас, К. Р., Медхабати, К., Нонгаллейма, К. К., и Деви, Х. С. (2014). Потенциал темно-фиолетового ароматного риса — от основных продуктов питания до нутрицевтиков. Curr. World Environ. 9: 3. DOI: 10.12944 / CWE.9.3.38

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Даяниди, Х., Сингх, Н. Дж., И Майбам, П. (2017). Разработка и рецептура лапши на основе Чак-хао (черный рис). CAU Res. Информационный бюллетень. 8, 14–17.

Google Scholar

Дэн, Г. Ф., Сюй, Х. Р., Чжан, Ю., Ли, Д., Ган, Р. Ю., и Ли, Х. Б. (2013). Фенольные соединения и биоактивность пигментированного риса. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 53, 296–306. DOI: 10.1080 / 10408398.2010.529624

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дурай А., Томар Дж. М. С., Деви П., Деви П., Аруначалам А. и Мехта Х. (2015). Разнообразие риса — сеть генетических ресурсов Северо-Восточной Индии. Indian J. Plant Genet. Ресурс. 28, 205–212. DOI: 10.5958 / 0976-1926.2015.00024.8

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гаячаран, Бишт, И.С., Пандей, А., Ядав, М.С., Сингх, А.К., Пандравада, С.R., et al. (2018). Структура популяции некоторых местных сортов ароматного риса ( Oryza sativa L. ) местных сортов Индии . Indian J. Biotechnol. 17, 110–117.

Google Scholar

GoI (2019). Chak-Hao — GI Application No. 602. Geogr. Показания J. 126, 13–23.

Google Scholar

GoM (2018). Economic Survey Manipur 2017-18. Лампхелпат: Управление экономики и статистики, правительство Манипура.

Google Scholar

Гуфо П. и Триндади Х. (2014). Антиоксиданты риса: фенольные кислоты, флавоноиды, антоцианы, проантоцианидины, токоферолы, токотриенолы, γ-оризол и фитиновая кислота. Food Sci. Nutr. 2, 75–104. DOI: 10.1002 / fsn3.86

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хедрик, П. У. (2000). Генетика популяций , 2-е изд. Бостон: Джонс и Бартлетт.

Google Scholar

Хор, Д.К. (2005). Сбор, сохранение и управление разнообразием риса на северо-востоке Индии. Genet. Ресурс. Crop Evol. 52, 1129–1140. DOI: 10.1007 / s10722-004-6084-2

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хоу, З., Цинь, П., Чжан, Ю., Цуй, С., и Рен, Г. (2013). Идентификация антоцианов, выделенных из черного риса (Oryza sativa L. ), и кинетика их разложения . Food Res. Int. 50, 691–697. DOI: 10.1016 / j.foodres.2011.07.037

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хантер Р.С. и Гарольд Р. В. (1987). Измерение внешнего вида , 2-е изд. Нью-Йорк: John Wiley and Sons, Inc.,

Google Scholar

IRRI (2013). Стандартная система оценки риса , 5-е изд. Лос-Баньос, PH: Международный научно-исследовательский институт риса.

Google Scholar

IRRI (2014). STAR версия 2.0.1. Биометрия и информатика селекции. Los Baños, PH: Международный научно-исследовательский институт риса.

Google Scholar

Ислам, М.Z., Khalequzzaman, M., Bashar, M.K., Ivy, N.A., Mian, M.A.K., Pittendrigh, B.R. и др. (2018a). Оценка изменчивости зародышевой плазмы ароматного риса по феногеномным признакам и анализ популяционной структуры. Sci. Отчет 8: 9911. DOI: 10.1038 / s41598-018-28001-z

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Islam, M. Z., Khalequzzaman, M., Prince, M. F. R. K., Siddique, M. A., Rashid, E. S. M. H., Ahmed, M. S. U., et al. (2018b). Разнообразие и популяционная структура зародышевой плазмы красного риса в Бангладеш. PLoS One 13: e0196096. DOI: 10.1371 / journal.pone.0196096

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джулиано Б. О. (1971). Упрощенный анализ амилозы измельченного риса. Cereal Sci. Сегодня 16, 334–340.

Google Scholar

Ху, Х. Э., Азлан, А., Танг, С. Т., и Лим, С. М. (2017). Антоцианидины и антоцианы: цветные пигменты в качестве пищевых продуктов, фармацевтических ингредиентов и потенциальная польза для здоровья. Food Nutr.Res. 61: 1361779. DOI: 10.1080 / 16546628.2017.1361779

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хуш, Г. С. (2000). «Таксономия и происхождение риса», в Aromatic Rices , ред. Р. К. Сингх, У. С. Сингх и Г. С. Хуш (Нью-Дели: Oxford and IBH Publishing Co. Pvt. Ltd), 5–13.

Google Scholar

Ким, М., Ким, Х., Кох, К., Ким, Х., Ли, Ю. и Ким, Ю. (2008). Идентификация и количественная оценка антоциановых пигментов в цветном рисе. Nutr. Res. Практик. 2, 46–49. DOI: 10.4162 / nrp.2008.2.1.46

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, Дж. Х. (2010). Идентификация и количественное определение антоцианов из зерен черного риса (Oryza sativa L.) сорта . Food Sci. Biotechnol. 19, 391–397. DOI: 10.1007 / s10068-010-0055-5

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лимтракул, П., Семмарат, В., и Мапунг, С. (2019). «Антоцианы и проантоцианидины в натуральном пигментированном рисе и их биоактивность», в Phytochemicals in Human Health , под ред.Рао, Д. Манс и Л. Рао (Лондон: IntechOpen), DOI: 10.5772 / intechopen.86962

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Литтл Р. Р., Хильдер Г. Б. и Доусон Э. Х. (1958). Дифференциальное действие разбавленной щелочи на 25 сортов измельченного белого риса. Cereal Chem. 35, 111–126.

Google Scholar

Мао, А. А., Хинневта, Т. М., и Санджаппа, М. (2009). Растительные богатства Северо-Восточной Индии с привязкой к этноботанике. Indian J. Tradit.Знать. 8, 96–103.

Google Scholar

Мигель М. Г. (2011). Антоцианы: антиоксидантное и / или противовоспалительное действие. J. Appl. Pharm. Sci. 01, 07–15.

Google Scholar

Murdifin, M., Pakki, E., Rahim, A., Syaiful, S.A., Ismail, Evary, Y.M, et al. (2015). Физико-химические свойства индонезийского пигментированного риса (Oryza sativa Linn.) сорта из Южного Сулавеси . Asian J. Plant Sci. 14, 59–65.DOI: 10.3923 / ajps.2015.59.65

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Начимуту, В. В., Мутураджан, Р., Дураялагураджа, С., Сиваками, Р., Пандиан, Б. А., Понниа, Г. и др. (2015). Анализ популяционной структуры и генетического разнообразия в зародышевой плазме риса с использованием маркеров SSR: инициатива по ассоциативному картированию агрономических признаков у Oryza sativa. Рис 8: 3030. DOI: 10.1186 / s12284-015-0062-5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Оикава, Т., Маэда, Х., Огучи, Т., Ямагути, Т., Танабе, Н., Эбана, К. и др. (2015). Рождение гена черного риса и его локальное распространение интрогрессией. Растительная клетка 27, 2401–2414. DOI: 10.1105 / tpc.15.00310

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Pathaichindachote, W., Panyawut, N., Sikaewtung, K., Patarapuwadol, S., and Muangprom, A. (2019). Генетическое разнообразие и частота аллелей выбранной зародышевой плазмы тайского и экзотического риса с использованием маркеров SSR. Rice Sci. 26, 393–403. DOI: 10.1016 / j.rsci.2018.11.002

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пиколл, Р., Смаус, П. Э. (2012). GenAlEx 6.5: генетический анализ в Excel. Популяционно-генетическое программное обеспечение для обучения и исследований — обновление. Биоинформатика 28, 2537–2539. DOI: 10.1093 / биоинформатика / bts460

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пойер Э., Маттиви Ф., Джонсон Д. и Стокли К. С. (2013). Аргументы в пользу потребления антоцианов для укрепления здоровья человека: обзор. Компр. Rev. Food Sci. Food Saf. 12, 483–508. DOI: 10.1111 / 1541-4337.12024

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Причард, Дж. К., Вэнь, X., Фалуш, Д. (2010). Документация для программного обеспечения Structure: версия 2.3. Чикаго, CL: Чикагский университет.

Google Scholar

Причард, Дж. К., Стивенс, М., и Доннелли, П. Дж. (2000). Вывод о структуре популяции с использованием данных мультилокусного генотипа. Генетика 155, 945–959.

Google Scholar

Рани, Н.С., Рао, Л.В.С., и Вирактаматх, Б.С. (2006). Национальные рекомендации по проведению испытаний на отличимость, однородность и стабильность: рис (Oryza sativa L) — нулевой проект. Хайдарабад: Управление исследований риса.

Google Scholar

Рой С., Банерджи А., Моклиенг Б., Мисра А. К., Паттанаяк А., Хариш Г. Д. и др. (2015). Генетическое разнообразие и популяционная структура ароматного и качественного риса ( Oryza sativa l.Староместные сорта из северо-восточной Индии. PLoS One 10: e0129607. DOI: 10.1371 / journal.pone.0129607

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рой, С., Банерджи, А., Паттанаяк, А., Рой, С.С., Рати, Р.С., Мисра, А.К. и др. (2014). Староместные сорта риса чахао ( Oryza sativa L.) северо-востока Индии: сбор, сохранение и характеристика генетического разнообразия. Plant Genet. Ресурс.-С. 12, 264–272. DOI: 10.1017 / S14179262113000580

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рой С., Марнди Б. К., Моклиенг Б., Банерджи А., Ядав Р. М., Мисра А. К. и др. (2016). Генетическое разнообразие и структура староместных сортов риса холмистого ( Oryza sativa L.) из северо-восточных Гималаев Индии. BMC Genet. 17: 107. DOI: 10.1186 / s12863-016-0414-1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рю, С. Н., Парк, С. З., и Хо, К. Т.(1998). Высокоэффективное жидкостное хроматографическое определение антоциановых пигментов некоторых сортов черного риса. J. Food Drug Anal. 6, 729–736.

Google Scholar

Сайкия С., Датта Х., Сайкия Д. и Маханта К. Л. (2012). Качественная характеристика и оценка содержания фитохимических веществ и антиоксидантной способности ароматических пигментированных и непигментированных сортов риса. Food Res. Int. 466, 334–340. DOI: 10.1016 / j.foodres.2011.12.021

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Самьер, Д., Дас, А.Б., и Дека, С.С. (2017). Пигментированный рис — потенциальный источник биологически активных соединений: обзор. Внутр. J. Food Sci. Technol. 52, 1073–1081. DOI: 10.1111 / ijfs.13378

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Seechamnanturakit, V., Karrila, T. T., Sontimuang, C., and Sukhoom, A. (2018). Натуральные пигменты в пигментированных рисовых отрубях и их связь со здоровьем человека: обзор литературы. Kmutnb Int. J. Appl. Sci. Technol. 11, 3–13. DOI: 10.14416 / j.ияст.2018.01.004

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шен, Ю., Лян, Дж., Сяо, П., Янь, Л., и Цзиньсун, Б. (2009). Общее количество фенолов, флавоноидов, антиоксидантная способность в рисовом зерне и их отношение к цвету, размеру и весу зерна. J. Cereal. Sci. 49, 106–111. DOI: 10.1016 / j.jcs.2008.07.010

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сингх Б. Д., Сингх А. К. (2015). Селекция растений с использованием маркеров: принципы и практика. Нью-Дели: Спрингер.

Google Scholar

Сингх Дж., Шарма К., Валиа С. и Саха С. (2017). Метод профилирования антоцианов, основанный на изократическом элюировании, для сопоставимой скорости, воспроизводимости и количественного определения с градиентным элюированием. Food Anal. Методы 10, 118–128. DOI: 10.1007 / s12161-016-0561-z

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сингх Н., Чоудхури Д. Р., Сингх А. К., Кумар С., Сринивасан К., Тьяги Р. К. и др. (2013).Сравнение SSR- и SNP-маркеров в оценке генетического разнообразия и популяционной структуры индийских сортов риса. PLoS One 8: e84136. DOI: 10.1371 / journal.pone.0084136

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сингх Н., Чоудхури Д. Р., Тивари Г., Сингх А. К., Кумар С., Шринивасан К. и др. (2016). Тенденция генетического разнообразия индийских сортов риса: анализ с использованием маркеров SSR. BMC Genet. 17: 127. DOI: 10.1186 / s12863-016-0437-7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сингх Р.К., и Багель, С. С. (2003). «Ароматические рисы Манипура», в «Трактат об ароматных рисах Индии », ред. Р. К. Сингх и У. С. Сингх (Нью-Дели: издательство Kalyani), 347–354.

Google Scholar

Слинкард, С., Синглтон, В. Л. (1977). Общий фенольный анализ: автоматизация и сравнение с ручными методами. Am. J. Enol. Viticult. 28, 49–55.

Google Scholar

Сокал Р. Р. и Миченер К. Д. (1958). Статистический метод оценки систематических взаимосвязей. Univ. Канс. Sci. Бык. 28, 1409–1438.

Google Scholar

Сомпонг Р., Зибенхандл-Эн С., Линсбергер-Мартин Г. и Бергхофер Э. (2011). Физико-химические и антиоксидантные свойства красных и черных сортов риса из Таиланда, Китая и Шри-Ланки. Food Chem. 124, 132–140. DOI: 10.1016 / j.foodchem.2010.05.115

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сомсана П., Паттанагул В., Сурихарн Б. и Саничон Дж. (2013).Стабильность и генотип по взаимодействию с окружающей средой для содержания антоцианов в зерне тайского черного клейкого риса с возвышенностей (Oryza sativa). САБРАО Дж. Порода. Genet. 45, 523–532.

Google Scholar